Библиотека Виртуальной Пустыни
Эмбриональная стволовая клетка
(от фундаментальной биологии к медицине)
В.С. Репин
Любой оптимизм в отношении потенций стволовых клеток должен быть уравновешен трезвой ответственностью в отношении близкой реализации надежд пациента. Пока новая концепция становится реальностью область преждевременно и неизбежно обрастает мифами. Поэтому сама клеточная биология стволовой клетки ничего прямо не может обещать медицине и пациентам.
Немного истории
Хотя термин "стволовая клетка" был введен в биологию Александром Максимовым в 1908 году на съезде гематологического общества в Берлине, статус большой науки эта область клеточной биологии получила в последнее десятилетие ХХ века. В начале 80-х годов ХХ века недифференцированные плюрипотентные линии стволовых клеток были получены из эмбриобласта(внутренней клеточной массы) бластоцисты мыши.( 9. 10, 22 ). Однако ЭСК привлекли всеобщее внимание в 1998 году после изолирования бессмертных линий ЭСК человека Д.Томсоном иД.Герхартом. В 1999 году журнал Science признал открытие ЭСК третьим по значимости событием в биологии после расшифровки двойной спирали ДНК и программы "Геном человека". Осознание важнейшей роли ЭСК в биологии и медицине состоялось в опережающем режиме, поскольку в открытой печати в 1999 году об ЭСК человека появилось не более 4-5 фундаментальных публикаций ( хотя биологические компании в конце ХХ века уже получили более 2500 патентов на новые технологии и манипуляции с ЭСК). Представляют интерес мотивы и аргументы лидирующих биологов, поставивших открытие ЭСК так высоко в истории биологии ХХ века.
Открытие двойной спирали ДНК изменило мышление в биологии, потому что материализовало силы и законы генетики в биологии. Уотсон и Крик впервые ввели в научный обиход новый термин - информационные молекулы. Они расшифровали , где наследственная информация хранится и как она работает. Устройство молекулы ДНК объяснило ее главные функции. Тот же Уотсон, комментируя через пол-века открытие ЭСК, заметил что устройство стволовой клетки (wet-ware) не дает прямых ключей к расшифровке программы функционирования (soft-ware) ЭСК. Один молекулярный поток информации от ДНК через мир мРНК в трехмерный мир белков не объясняет алгоритма стволовых клеток, поскольку под влиянием внешних инструкций одна ЭСК может превратиться в зародыш, либо в линию специализированных соматических клеток. В случае эмбриогенеза функцию мессенджера-кассет информации на языке мРНК обеспечивают клетки провизорных органов с так называемым "минимальным фенотипом". Эти клетки действительно являются минидискетами информации в виде наборов мРНК, которые не трансформируются в устройство (фенотип) клеток. Клетки провизорных органов зародыша существуют короткое время только для переноса и реализации программ эмбриогенеза. Эти провизорные клетки без белкового фенотипа занимают то же промежуточное место в эмбриогенезе, как мРНК в передаче информации от ДНК в мир белков. В случае созревания ЭСК в специализированную клеточную линию прогениторные и бластные популяции клеток также выполняют роль переносчиков информации на языке мРНК в терминально специализированные клетки.
Эволюция манипулирует одной исходной тотипотентной клеткой, которая с помощью внешней информации подгоняет свое устройство для наиболее адэкватной функции, которая реализуется белковыми машинами. С помощью информации устройство клеток наиболее эффективно подгоняется под контекст местных химических условий ( прежде всего ассортимент молекул микроокружения для создания потоков энергии и строительных веществ в клетки). Software клеток используется не на энергию активации или модификации внешнего "сырья", а на подгонку рецепторов,ионных каналов и белков-переносчиков к источнику "сырья" за счет создания высокоаффинных распознований и перетаскивания молекул в клетки.
Сеймур Бреннер указал, что открытие ЭСК ведет к самому простому и экономичному способу долгосрочного макромасштабного выращивания специализированных клеток человека. Ранее выращивание клеток человека в плотностях двухмерной первичной культуры на пластике всегда вело необратимой дедифференцировке и утрате полезных функций гепатоцитами, нейронами, мышечными клетками. Только недавно было устновлено, что соматические клетки человека стабильно держат фенотип при плотности 1млрд/мл и при наличии ядра из мезенхимальных клеток. Такое устройство функциональныъ единиц органа можно получить лишь из ЭСК
рекапитулируя эмбриогенез органа.
Культивирование недифференцированных стволовых клеток зародыша мышей стало возможным блягодаря двум техническим новшествам: добавлению leukemia inhibitory factor (LIF) - блокатора дифференцировки клеток. Во-вторых, выращивание стволовых клеток из предимплантационных зародышей требовало слоя фидерных клеток- производных мезенхимы( чаще всего используются фетальные фибробласты первых трех пассажей). На первом этапе изучение стволовых клеток из бластоцисты мышей использовалось в основном для изучения закономерностей органогенеза и получения химерных зародышей. В 1998 году Джеймс Томсон ( Висконсинский университет, США) опубликовал в Science статью о выделении 5 бессмертных линий эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) из эмбриобласта бластоцисты человека. (30). Одновременно Джон Герхарт ( Университет Джона Гопкинса, США) в Анналах национальной академии США предложил метод выделении бессмертных линий ЭСК из полового бугорка 4-5 нед фетусов.( 28 ). В 1999 году журнал Science признал открытие ЭСК человека третьим по важности событием в биологии ХХ века ( после открытия двойной спирали ДНК и программы "Геном человека"). Эти кульминационные и полу-сенсационные события вокруг ЭСК в последние годы ХХ века были подготовлены не столько методическим прорывом в культивировании ЭСК, сколько успехами функциональной геномики и клеточной трансплантации. Биологи и генетики впервые получили в руки прототип той "клетки-проматери", которую в процессе длительного отбора эволюция выбрала для повторения вида в каждом новом поколении. Программа тотипотентности существует в ооците, зиготе и бластомерах. Однако эти клетки пока невозможно клонировать и пассировать в количествах, необходимых для анализа профиля мРНК и белкового фенотипа. Фактически ЭСК является уникальным биологическим Розеттским камнем, хранящем коды трехмерной карты зародыша и коды линейной рестрикции специализированных линий в файлах провизорных клеток. Программа развития упакована наборами клеток-предшественников без фенотипических маркеров, которые появляются с началом гаструляции. Информация, собранная на языке мРНК этих провизорных клеток, ждет своего Била Гейтса для расшифровки. Мы кратко проследим ретроспективу событий, чтобы лучше уяснить суть перемен на стыке эмбриологии, клеточной биологии и функциональной геномики.
Ни одна область биологии при своем рождении не была окружена такой сетью предубеждений, враждебности и кривотолков, как ЭСК. На Западе эта область на 10 лет было фактически приватизирована биотехнологическими компаниями из-за "моратория" на федеральную науку вокруг ЭСК. За 10 лет учеными частных компаний было получено более 1500 патентов на различные способы изолирования, культивирования, модификации ЭСК для научно-практических исследований. По причине полной закрытости и обстановки строгой секретности вокруг ЭСК на Западе в обществе превалировало недоверие и предубеждения, особенно на стыке с геномикой, где многие области также остаются предметом публичных дебатов. В нашей стране отсутствие знаний и эффективного государственного контроля привело к тому, что рынок медицинских услуг оказался захваченным псевдотехнологиями. Дилетантское обсуждение проблемы ЭСК начинается с трансплантации и клонирования организмов. Серьезное обсуждение проблемы должно начинаться с клеточной биологии ЭСК. В данном обзоре мы кратко остановимся на главных направлениях и результатах фундаментальной клеточной биологии ЭСК.
Линии ЭСК из тератокарцином
В конце 50-х годов ХХ века Лерой Стивенс , работая в США на грант частной компании, изучал эффекты табака и сигаретной бумаги на частоту возникновения опухолей и другой патологии у линейных мышей. Отрабатывая показатели контрольных животных, он обнаружил необычно высокую частоту возникновения тератокарцином в половых зачатках мышей линии 129. В этих опухолях спонтанно возникали клетки нервной системы, кожи, клетки волос, хряща, фрагменты костной ткани и другие неорганизованные массы дифференцированных клеток. Несколько лет Стивенс занимался скрещиванием и селекцией мышей 129 для получения суперлинии с максимальной частотой развития спонтанных тератокарцином. Пассируя спонтанно возникшие опухоли через несколько поколений животных, Стивенс получил более однородную популяцию раковых клеток с удивительными свойствами. ( 20 ). При введении в брюшную полость клетки они формировали крупные клеточные агрегаты, в которых копировались фрагменты эмбриогенеза ( образование скелетной мышцы, сердца, кожи, волос, нервной ткани, кости, мышц). В культуре клетки тератокарциномы также обнаруживали "аномалии поведения": росли неприкрепленными к подложке клонами плюрипотентных клеток, способных дифференцироваться в разнообразные линии соматических специализированных клеток. Стивенс первым показал, что химический состав асцитной жидкости, а также добавленные дифференцированные клетки и ткани влияли на образование специализированных клеточных линий из незрелых клеток тератокарциномы. Стивенс выявил сходство клеток тератокарциномы с клетками эмбриобласта предимплантационных зародышей. Он первым получил тератокарциномы , вводя суспензию клеток эмбриобласта в ткани взрослых мышей. Выросшие опухоли, возникшие после трансплантации клеток эмбриобласта, были переведены в линии. При введении в брюшную полость крыс-реципиентов эти незрелые клетки линии дифференцировались в нейроны, кардиомиоциты и другие соматические клетки- дериваты трех зародышевых листков. Стивенс первым высказал догадку, что работает с смешанной культурой раковых и эмбриональных прогениторных клеток полового зачатка. Эту примесь эмбриональных нераковых клеток он назвал "эмбриональными плюрипотентыми клетками". Позднее удалось подсчитать, что в первичных линиях тератокарциномы содержится не более 0,1% ЭСК. Термин Стивенса "эмбриональная плюрипотентная стволовая клетка" прижился в научной литературе. После Стивенса во многих лабораториях мира было изолировано более 100 линий ЭСК из разных образцов опухолевой ткани.
В середине 70-х годов Беатрис Минтц и Карл Илминси из Ракового института (Филадельфия) первыми получили аллофенных мышей,смешивая клетки тератокарциномы 129 с зародышами на стадии 8- 100 клеток. Было доказано, что донорские гетерогеномные ЭСК эффективно встраиваются в развивающийся зародыш, формируя ростки донорской ткани в костном мозге, кишечнике, коже, печени, кишечнике и других участках зародыша и новорожденных, вплоть до химеризации ткани половых органов. С помощью пересадок ЭСК была налажена технология получения взрослых аллофенных мышей, органы которых были мозаично собраны из собственных/донорских клеток. Этот подход эмбриологи использовали для подсчета числа founder cells, формирующих печень, головной мозг, тимус, кожные покровы и т.п. Имплантация донорских ЭСК в ранний зародыш никогда не сопровождалась малигнизацией тканей или появлением опухолевых клонов ( в отличие от поведения ЭСК в тканях взрослого реципиента).С помощью пересадок ЭСК в ранние зародыши впервые были получены зародыши и взрослые особи- межвидовые химеры типа мышь-крыса, свинья-корова, "гуманизированная" свинья. Нормальный цикл развития проходили только те межвидовые гибриды, в которых донорские ЭСК давали ростки специализированных клонов в органах, но не давали морфологических химер.ЭСК крысы, например, при пересадках в зародыш мыши не влияли на план эмбриогенеза и работу гомеотических генов.
Поскольку линии ЭСК получают из эмбриобласта, это указывает, что генетические потенции стволовых клеток ограничены морфогенезом зародыша. Действительно, плацента и коммуникации зародыша с маткой образуются из клеток трофэктодермы. В виде исключения нормальные зародыши мыши развиваются из донорских ЭСК мыши, помещенных в "матрикс" тетраплоидной морулы, в которой деление клеток было предварительно остановлено цитокалазином. Клетки неделящейся морули не участвуют в построении зародыша, но поставляют ЭСК необходимую информацию.
Следующий методический прорыв был сделан Мариусом Капеччи, разработавшим метод двойного выключения (нокаута) аллельной пары генов в ЭСК мышей. ( техника направленной рекомбинационной делеции генов воспроизводится пока только в ЭСК мышей, но не других видов).( 5 ) При смешивании 60-80 мутантных ЭСК с с 20-30 клетками нормальных предимплантационных зародышей получают развивающуюся химеру, закладки органов которой получают варьирующую долю донорских и реципиентных клеток. Зародыши-химеры позволяют выяснять вклад неизвестных генов в в гаструляции и органогенезе ( часто один ген контролирует разные функции в разных закладках). Компьютерным способом эти данные интегрируются в функциональную карту генов в развивающихся зародышах мыши. На таких мышах-химерах была открыта функция гена SF-1 в закладке надпочечника и половых зачатков; функция Wt-1 гена в закладке почки, генов семейства MyoD в закладке скелетной мышцы, генов семейства GATA-1-4 в рестрикции зачатков эритро- и лимфопоэза. Особо важную роль сыграли ЭСК мышей с двойным нокаутом в расшифровке областей скопления генов на 7-й хромосоме мыши ( практически полной копии скопления генов на 19-й хромосоме человека), а также 16 сМ проксимальный участок 11-й хромосомы мыши ( копия 5q пятой хромосомы человека). Данные по делециям этих генов в ЭСК -\- мышей позволили оценить функции неизвестных генов человека в разных органах.
В настоящее время ЭСК мыши с двойным нокаутом практически любого гена поставляются на рынок биотехнологическими компаниями за 1500-2000 ам.долларов / 2-3 млн клеток. ЭСК с двойной гомоделецией генов оказались наилучшей моделью для изучении функции генов трех зародышевых листков, генов сегментации и гомеозиса. Эмбриология с помощью трансплантации ЭСК быстро продвинулась и по пути получения межвидовых зародышей- гибридов ( мышь-крыса, свинья-корова и т.п.). Зародыши-химеры либо погибали внутриутробно, либо развивались нормально в постнатальном периоде, сохраняя морфогенез вида, клетки которого преобладают в химере. Трансфекция неизвестных клонированных генов человека и животных в ЭСК мыши также используется для выяснения их функции. За последние годы техника химеризации стала столь эффективной, что пересадки единственной донорской ЭСК в 8-клеточный зародыш вызывает химеризацию нескольких органов ( 27 ). Немецкие специалисты получили "гуманизированную" мышь путем введения гематогенных стволовых клеток человека в бластоцисту ( 12).
В зародышах мыши на стадии органогенеза обнаружены циркулирующие в крови плюрипотентные ЭСК, биологические функции которых только начинают изучаться .С помощью двойных нокаутов гена дистрофина в ЭСК удалось вывести линию мышей, точно копирующую мышечную дистрофию Дюшенна человека. С помощью выключения гена АТМ ( контролируюшего синтез сигнальной киназы хроматина) в ЭСК удалось получить линию мышей, копирующую фатальную наследственную болезнь детей-атаксию-телангэктазию. При этом наследственном заболевании наблюдается дегенерация клеток Пуркинье в мозжечке, инволюция тимуса из-за быстрой гибели пролиферирующих клеток ( на почве дефектов репарации ДНК). Клинические, физиологические и морфологические симптомы заболевания точно копируются на мышах-химерах, полученных с помощью ЭСК, привносящих в зародыш информацию о болезни). Практически подавляющую часть наиболее распространенных наследственных гомозиготных заболеваний человека сейчас удается копировать на " нокаутированных" мышах (болезни углеводного, липидного обмена, болезни катаболизма аминокислот, выведения меди, билирубина и т.п.) . Медицина пополнилась обширным каталогом новых лабораторных "болезней" животных, которые в основном используются на стадии предклинических исследований.
Огромное влияние на развитие концепции эмбриональной стволовой клетки оказали программа "Геном человека", открытие , изолирование и секвенирование более 5000 генов эмбриогенеза человека, млекопитающих, дрозофилы, червей, функция которых во многом остается неизученной. Трансфекция неизвестных генов в геном ЭСК мышей оказалась весьма полезным инструментом для грубой оценки функции новых клонированных генов развития. Например, перенос гена Crypto человека позволил идентифицировать стадию его участия в закладке и формировании кардиогенной мезодермы мыши. Перенос клонированного гена человека Рах-6 в мышцу или рыхлую соединительную ткань мыши индуцировал образование "лишнего" глаза мыши. Этим способом было установлено, что донорский Рах-6 ген человека (либо дрозофилы) в организме мыши всегда индуцировал образование глаза реципиента ( но не донора). Серийный анализ генной экспрессии ( serial assay of gene expression) был использован несколькими фирмами для изучения карты экспрессии генов в незрелых пролиферирующих ЭСК тератокарциномы и бластоцисты мыщей.(16) Эти приватизированные данные нигде официально не опубликованы. Однако косвенные ссылки на эти работы подтверждают, что в ЭСК экспрессированы все 1000 генов, относящиеся к энергетическому и метаболическому блоку ( здесь особых различий с специализированными гомогенотами клеток не обнаружено). Однако подавляющая часть (90%) генов транссигнализации, координирующих работу рецепторов и экспрессию генов в ядре, оказалась репрессированной. (16) В специализированных клетках-гомогенотах экспрессировано порядка 500 генов транссигнализации.
Главные источники ЭСК млекопитающих и человека
Для лабораторных исследований линии мышиной тератокарциномы ( 129/sv, F19, F8, JM-1, E14TG2a, Zin 40, CGR 86, R1, CCE) и тератокарциномы человека (NTERA-2, TERA-2, H-9 clone, линии ЭСК Траунсона ( Австралия) остаются наиболее распространенной и воспроизводимой клеточной моделью. Более 100 коммерческих линий ЭСК -производных тератокарцином мышей и человека продаются биотехнологическими компаниями с подробным клеточным пасспортом (иммунофенотип, хромосомный анализ, профиль экспрессии мРНК, профиль экспонированных рецепторов и белков внутриклеточной сигнализации). Существенным недостатком некоторых линий ЭСК тератокарцином является быстрая утрата тотальной потентности в пассажах. Вторым недостатком тератокарцином являются их ограниченные возможности в клинике. Третьим недостатком ЭСК из тератокарцином является смешанная дифференцировка клеток в культуре, трудность получения одной специализированной линии клеток. Поэтому не прекращался поиск ЭСК из других источников.
В 1998 году Джеймс Томсон ( Висконсинский университет, США) изолировал несколько линий бессмертных ЭСК из бластоцисты человека (30). Источником ЭСК послужили предимлантационные зародыши, остающиеся неиспользованными для создания беременности. после процедуры суперовуляции и дублирования стадии искусственного оплодотворения. Зародыши для получения ЭСК обязательно замораживают.В питательной среде Дульбекко-Игл 5-10 зародышей с помощью микроманипулятора разделяют на эмбриобласт и трофобласт, собирают клетки эмбриобласта, визуализируя их с помощью меченых антител. ( Рис 2 А) Эмбриобласт превращают в суспензию клеток с помощью диспазы/коллагеназы и выращивают в специальной питательной среде с добавлением трех цитокинов (LIF, IL-6, SCF). В отличие от зрелых клеток ЭСК растут клонами, которые диссоциируют повторным пипетированием. Новые клоны возникают в суспендированной культуре через 5-7 дней. Максимальная скорость роста ЭСК достигается повторным суспендированием клонов на стадии 10-15 клеток.( Рис 2 Б) . Каждый клон переносят в микроячейку и выращивают до агрегата из 40-50 клеток. Процедуру повторяют многократно в пассажах, увеличивая объем культуры до плотности 5-10 млн клеток на 6см чашку. Путем пассирования было изолировано 10 бессмертных клонов ЭСК человека, которые через 100 пассажей сохранили высокую теломеразу, высокий темп клеточных делений, минимальный фенотип и тотальную потентность ( способность дифференцироваться в любую из 350 специализированных линий - производных эктодермы, мезодермы и энтодермы.( Дифференцировка ЭСК начинается при смене среды, добавлении сыворотки и элиминации LIF из среды). Обычно дифференцировка начинается с прикрепления клеток к подложке, поскольку цитоскелет и рецепторы адгезии играют важную роль в проведении внешних сигналов в клеточное ядро. При неограниченной пролиферации ЭСК человека устойчиво сохраняли кариотип в пассажах. .
Пролиферация клонов ЭСК в культуре имеет особенности. Каждый клон имеет одну стволовую клетку, которая подвергается асимметричному митозу. Одна из дочерних клеток сохраняет место и статус бессмертной тотипотентной клетки. Вторая клетка делится и дифференцируется в прогениторные слои клеток.( Рис 1) Причем периферические слои клона делятся более интенсивно, чем центральные. Экспоненциальный рост клона затухает из-за гибели краевых клеток, вступающих в ококнчательную диффренцировку. Число клеток в клоне не меняется, когда скорость пролиферации клеток уравновешена скоростью апоптоза и миграции одиночных клеток из клона. Рост клоногенной культуры определяется тремя параметрами: числом клонов в мл, численностью клеток в клоне на общее число клеток в культуре и длительностью роста/обновления клонов в культуре.
В 1998 году Джон Герхарт с сотрудниками ( Медицинская школа университета Джона Гопкинса, США) впервые изолировали бессмертные линии половых прогениторных клеток (ППК) из полового зачатка фетусов 4-5 нед развития.
( 28 ). Ранее Бриджит Хогэн сумела изолировать ППК из полового зачатка мышей. ППК появляются в половом бугорке зародышей путем миграции ППК желточного мешка.(25) Обычно линии ППК выделяли из ткани фетального бугорка 4-5 нед зародышей. Для полной солюбилизации ткань обрабатывали смесью коллагеназы IV-V, гиалуронидазы, ДНК-азы. Основная масса ППК упакована в "купели", собранными из стромальных клеток Сертоли. Клетки Сертоли создают иммунный барьер, специальную микросреду для выживания ППК и сохранения их в неактивном состоянии. Строма необходима для созревания гамет. Первичную культуру ППК выращивали на слое фидера (первый-второй пассаж фетальных фибробластов). Для стимуляции пролиферации ППК в среду культивирования добавляли bFGF, LIF и форсколин (стимулятор уровня цАМФ). В культуру ППК добавляли 15% фетальной сыоротки (HyClone). ППК также размножались клонами ошаренных клеток в суспензии ( 28 ).
Четвертый источник получения ЭСК человека был предложен сотрудниками Гарвардской медицинской школы. Соматическое клетки фетуса с помощью электрического разряда сливали с яйцеклеткой коровы, из которой предварительно удалялся пронуклеус. Такой неприродный гетерогеномный " гибрид" не только без помех проходит предимплантационные стадии развития, имплантируется в матку коровы, но внутриутробное развитие заканчивается рождением нормальных плодов. Метод позволяет получать гибридные бластоцисты, а из них получать ЭСК человека в обход беременности и фетальных тканей. Это позволяет избавляться от биоэтических проблем вокруг фетальной ткани и абортов. Однако ЭСК-цитогибриды породили новые правовые и этические дискуссии . Известно, что введение ЭСК крыс в зародыш мыши заканчивается рождением мыши-химеры, органы которой содержат ростки клеток крысиного происхождения. Не известны потенции, генетические возможности и жизнеспособность "межвидовых" зародышей,собранных из ядра человека и цитоплазмы коровы. Как известно, на манипуляции с зародышами человека наложен мораторий: исследования невозможны в академических учреждениях на деньги налогоплательщиков. Работы с ЭСК-цитогибридами ведутся частными компаниями и держатся в строжайшей тайне ( включая технологии "гуманизации" крупного рогатого скота с помощью ЭСК человека). Правовые, научные, этические аспекты в области межвидовой химеризации зародышей остаются непроработанными. Границы возможного на стыке генома двух видов наукой и обществом пока не установлены. В 2000 году в Австралии, Англии и Японии был отменен мораторий на государственные бюджетные исследования ЭСК человека, включая возможность получения ранних ( 100-120 клеточных) "межвидовых" цитогибридов типа "человек-свинья", "крыса-мышь". Это разрешение необходимо для разработки новых источников ЭСК в обход беременности и фетальных тканей. Пересаживая ядро соматической клетки человека в яйцеклетку коровы, получают цитогибридную клетку, которая в культуре повторяет начальные стадии эмбриогенеза и достигает стадии бластоцисты. Далее из этих зародышей выделяют эмбриобласт и получают из него линии бессмертных ЭСК по методу Томсона. Этот метод позволяет получать нелимитированные количества ЭСК из генома "заказчика" и далее их использовать для трансплантации без риска иммунных осложнений. В США по-прежнему существует мораторий на получение бластоцист-межвидовых гибридов.
В самые последние годы бессмертные линии ЭСК изолированы из эмбрионов кроликов, свиней, приматов, рыб, некоторых домашних животных. Все ЭСК имеют близую морфологию, фенотип и почти идентичный набор молекулярных машин для запуска развития.
Основные характеристики ЭСК ин витро
В отличие от специализированных соматических клеток, ЭСК сохраняют уникальную генетическую потенцию без текущей специализации.Эти клетки имеют так называемый минимальный фенотип и минимум рецепторов и программ для взаимодействия с микроокружением, поскольку лишь 5% из 500 генов транссигнализации экспрессировано в пролиферирующих ЭСК. Эти прямые измерения потвердили предположение, что ЭСК сохраняют тотальные генетические потенции за счет выключения "программ" специализации и рестрикции клеточных линий.
Второй важнейшей характеристикой ЭСК в культуре является практически неограниченный потенциал пролиферации , обусловленный особенностями фенотипа незрелых клеток. Гетеродимерный комплекс рецептора , общий для связывания трех цитокинов (LIF, SCF, IL-6), обеспечивает одновременную передачу сигнала от трех изоформ рецептора через общую трансмембранную субъединицу gp-130 и Jak-Stat3 транскрипционный комплекс на "батарею" генов, контролирующих клеточный митоз. Опознающий домен Stat3 ( SIE DNA-binding site) специфически взаимодействует с промотором c-fos на уровне ДНК хроматина. Нокаут LIF- рецептора, либо Stat3 в ЭСК мышей вызывает необратимую остановку пролиферации клеток в полной ростовой среде в присутствии LIF, SCF и IL-6 ( 2 ,15).
Другой особенностью ЭСК является рост суспензионными клона
ми без какой-либо примеси продвинутых клеток, прикрепленных к подложке. Каждый клон в такой культуре является производным одной прародительской ЭСК. Только ЭСК в клоне делится так называемым асимметричным делением.(Рис 1 ) После деления лишь одна клетка сохраняет место и потенции бессмертной клетки в клоне, тогда как вторая клетка образует второе, третье поколение прогениторных клеток. Прогениторные клетки делятся симметрично, поскольку обе дочерние клетки имеют сходную судьбу и неизбежно дифференцируются в зрелые узко специализированные линии. Поскольку клон растет периферией, сперва наблюдается экспоненциальная фаза роста, переходящая в стадию равновесия. В ткани прогениторный слой переходит в слои дифференцированных клеток. В культуре в селективной ростовой среде краевые клетки клона, входящие в дифференцировку, гибнут и элиминируются. Поэтому в стадии равновесия (renewal) численность клеток в клоне держится на плато за счет баланса пролиферации/ гибели + миграции клеток из клона. Поведение клоногенной культуры ЭСК описывается следующими параметрами: 1) числом клонов на мл 2) отношением числа клонов/общему числу живых клеток в культуре 3) гетерогенностью клонов по размерам, скорости роста, генотипическим и фенотипическим маркерам. В клоногенной культуре отношение ЭСК/ прогениторные клетки варьирует. ЭСК составляют доли процента от прогениторных популяций. ЭСК возникают только из ЭСК, но не прогениторных клеток. Только эффективное пипетирование и своевременная дезагрегация клонов может увеличить число ЭСК в культуре.
В отличие от специализированных клеток, ЭСК для выживания и функционирования в культуре нуждаются в слое поддерживающих стромальных клеток "фидера", выполняющих множественные метаболические, сигнальные и иммунопротекторные функции несколькими путями:
1) поддержание выживания ЭСК с помощью секретируемых цитокинов и ростовых факторов ( в том числе блокирующих апоптоз)
2) блокада прямомого контакта ЭСК с адгезивной подложкой и формированию цитоскелета 3) формирования иммунологического барьера. За последнее время открыты и изучаются новые пути и механизмы взаимодействия ЭСК с стромальным микроокружением. Если поддержание жизнеспособности клонов требует LIF, SCF, IL-6, то размножение прогениторных слоев клеток зависит от bFGF, EGF, TGF-alpha и других сигналов. При этом длительная пролиферация ЭСК/прогениторных клеток в клонах не сопровождается аномалиями кариотипа. Фенотипические характеристики ЭСК и ППК остаются неизменными после 20-50 пассажей ( хотя некоторые клоны теряют тотипотентность). Культура растет плотно организованными клонами,в которых клетки формируют межклеточные контакты, резистентные к трипсину.
Пролиферирующие незрелые ЭСК пока идентифицируются скудным набором фентипических маркеров. На поверхности плазматической мембраны ЭСК человека и приматов обнаружены уникальные липидные антигены SSEA-3, SSEA-4, представляющие комплекс гликолипида GL7 с сиаловой кислотой. На поверхности ЭСК идентифицировано два высокополимерных гликопротеида TRA-1-81, TRA-1-60, а также щелочная фосфатаза. В отличие от более продвинутых прогениторных популяций герментативного эпителия ППК не имеют на своей поверхности бета-интегрина, но содержат высокую активность щелочной фосфатазы. Наиболее важными внутриклеточными маркерными белками являются Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, относящимся к так называемым белкам-сайленсерам хроматина. С их помощью происходит особо компактная упаковка гетерохроматина, препятствующая образованию петель эухроматина. Опосредованная этими белками упаковка хроматина неизвестным пока способом коррелирует с тотипотентностью генома этих клеток. К месту отметить, что зрелые яйцеклетки крупного рогатого скота и человека являются единственным видом специализированных клеток, содержащих высокие концентрации белков-сайленсеров в цитоплазме. На этом основании был разработан метод получения гибридных ЭСК путем переноса ядер соматических клеток в безядерные яйцеклетки коров. Цитоплазма яйцеклеток возвращала ядрам соматических клеток тотипотентность за 12-24 часа в культуре. Биохимическая основа и сигнальная программа тотипотентности генома клеток млекопитающих и человека только начинает изучаться. Не трудно видеть,что решение этой проблемы открывает новые реальности в медицине ближайшего будущего.
Незрелые пролиферирующие ЭСК в клонах сохраняют ошаренную форму и не прикрепляются к подложке, потому что они не имеют сформированного цитоскелета и рецепторов адгезии. Известно, что внутриклеточный механо-опорный и локомоторный остов клетки играют важную роль в проведении сигналов между плазматической мембраной и ядром. Поскольку линии ЭСК - это клетки с виртуальной специализацией (функцией), то критерии и характеристики для стандартизации такой популяцией принципиально отличаются от критериев и стандартов, екоторые используются для специализированных клеточных линии, имеющих максимальный фенотип и нуль генетической потенции.
Пролиферация ЭСК в культуре не зависит от Нох-генов
В отличие от ситуации в целом зародыше, пролиферация ЭСК ин витро разобщена с образованием зародышевых листков и включением гомеозисных Нох-генов, размечающих трехмерный план и карту провизорных и окончательных органов зародыша. Как известно, гены сегментации и органогенеза работают не только в клетках паренхимы, но и клетках мезенхимы, согласованно выполняя разные программы ( от закладки сомитов, сегментации зародыша, формирования желточного мешка, аллантоиса, других провизорных органов и тканей до размежевания территории между органами). Между ЭСК и конечными 350 рестрикционными специализированными линиями проходит много раундов клеточных делений. Зародыш на ранних стадиях сегментации напоминает "клеточную матрешку", где в недрах одного клона провизорных клеток, возникают новые и новые клоны, распечатывающих программу развития комбинациями мРНК. Синхронное образование новых и новых клонов провизорных клеток без фенотипа необходимо и для ее пространственной реализации. Размножаясь, эти новые клоны этап за этапом заполняют запроектированное пространство будущего организма. Клоны провизорных клеток зародыша выполняют роль промежуточных "дискет" для построения трехмерной карты зародыша.
Как известно, комбинации Нох-генов предопределяют не только топографию провизорных и дефинитивных органов, форму и размеры органа, включая численность клеток, но и порядок сборки паренхимы в функциональные единицы.( дольки печени, нефрон, ворсинка с криптой, альвеола, островок Лангерганса и т.п.)
В культуре ЭСК с неорганизованным ростом клонов, пролиферация клеток не сопровождается включением генов гомеозиса, в том числе на стыке слоев паренхимы/мезенхимы. Сигнальные взаимодействия между паренхимой и мезенхимой необходимы для закладки и формирования инфраструктуры органов. Внешний сигнал LIF в синергизме с белком-сайленсером Oct3/Oct4 удерживают геном пролиферирующих ЭСК в тотипотентном состоянии. В бластоцисте мышей Oct4 экспрессирован только в эмбриобласте, но индуцирует экспрессию гена для FGF-4 в трофобласте. У мышей двойной нокаут гена Oct4-/- ведет к эли
минации герментативного эпителия и клонов ППК.( 2 ). Фенотипические характеристики пролиферирующих ЭСК и ППК остаются неизменными после 20-30 пассажей ( включая высокий уровень теломеразы). Культура растет в основном плотными клонами с хорошо развитой сетью межклеточных контактов. Мышиные ЭСК растут наиболее плотными клонами мелких клеток с минимальной каемкой цитоплазмы.Мышиные ЭСК образуют максимальное число межклеточных контактов в клоне. ЭСК обезьян формируют более плоские колонии клеток с неровными краями. В ранних клонах легко просматриваются отдельные клетки. ЭСК человека дают наиболее крупные агрегаты с характерными оформленными краями. Пролиферирующие ЭСК не экспрессируют антигены гистосовместимости I и II типа.
ЭСК - минимодель возникновения зародышевых листков
В геноме человека и млекопитающих обнаружено около 14500 генов эмбриогенеза, обеспечивающих построение всех специализированных клеточных линий, собранных в органы и функциональные единицы тканей. Их принадлежность к эмбриогенезу доказывается тем, что 12000 "архитектурных" генов отсутствуют в геноме низших и беспозвоночных. ЭСК является уникальной моделью для расшифровки времени и места действия генов развития.В отличие от генов гомеозиса, рестрикционное созревание ЭСК в специализированные клеточные линии в культуре происходит с участием "master-genes" трех зародышевых листков. Спонтанное включение первых генов экто-, энто- и мезодермы in vitro происходит со стадии образования крупных эмбриоидных телец. Если из среды убрать LIF,одновременно перенося клетки в культуральную чашку без фидера, то начинается спонтанная смешанная дифференцировка клонов. Ранее всего дифференцировка эмбриоидных телец была изучена в культуре ЭСК тератокарциномы.В суспензионных агрегатах ЭСК спонтанная дифференцировка клеток идет топографически в обратном порядке по сравнению с зародышем in situ: наружний слой дифференцируется в энтодерму, средний слой- в мезодерму, а "ядро" клона - в эктодерму (23). Появление клеток эктодермы идентифицируется по экспресии гена Brachyury, эктодермы - по экспрессии генов nodal,Oct3, FGF-5 ; энтодермы - по экспрессии гена GATA-4. В агрегатах эмбриокарциномы Р19 экспрессия первого гена мезодермы -Brachyury - начинает нарастать, когда идет на убыль экспрессия генов тканевого активатора плазминогена, альфа-фетопротеина, кератина 8 и 19 - маркеров первых мигрирующих популяций мезодермы. Миграция новообразованных стволовых и прогениторных клеток в гаструле играет не менее важную роль, чем пролиферация. В период гаструлы впервые в зародыше появляются популяции незрелых клеток, наделенных главным образом навигационной информацией. Многие отделы мозга, костно-лицевого черепа, периферическая нервная система, проводящая система сердца, тимус собраны из "пришлых" клонов клеток Поэтому маркировка клеток по ранним генам зародышевых листков помогает составить топографию миграции провизорных клеток в развивающемся зародыше. Недавно обнаружили второй "маркер" мезодермы, экспрессируемый ин витро и ин ситу. Им оказался ген zeta-globin .Описаны и новые маркеры эктодермы ( 23 ). Реже в культуре ЭСК наблюдается спонтанная экспрессия master gene кардиогенной мезодермы (Nkx-2-5), нейральной трубки (Msx3), провизорного кроветворения в желточном мешке (EKLF) в клонах культуры. Функционирование ранних генов зародышевых листков идет в культуре неупорядоченно, зачастую лишь фрагментами программы. В целом зародыше возникновение зародышевых листков, сегментация и миграция клеточных потоков в первую очередь задействовано на образование провизорных органов, являющихся временным органом для переадресовки и пересылки региональных стволовых клеток ( нейральная трубка является источником нейрональных стволовых клеток; , нервный гребень- источником мигрирующих нейроэпителиальных и мезенхимальных прогениторных популяций, желточный мешок является источником региональных стволовых клеток кроветворения, эндотелия, герментативного эпителия, стволовых клеток мышечной системы). Образование временных провизорных органов для аккумуляции, хранения и пересылки региональных стволовых клеток происходит в результате согласованных взаимодействий экто- мезо- и энтодермы с мезенхимой. В культуре "эмбриоидных телец" из ЭСК одновременно с включением генов трех зародышевых листков происходит образование специализированных клонов. Однако спонтанная дифференцировка нейронов, кардиомиоцитов, клеток кроветворения идет по укороченной программе без предварительного накопления и размножения региональных стволовых клеток.
Хотя естественные события гаструляции идут хаотично в культуре, эмбриоидные агрегаты дают недвусмысленную информацию, особенно с помощью векторной доставки генов развития в ЭСК. Так, направленную дифференцировку ЭСК в кардиомиоциты можно вызвать внешними сигналами. В этом случае добавляют выверенную дозу ретиноевой кислоты и дибутирил-цАМФ на 7-11 день культивирования агрегатов. Во втором варианте для получения кардиомиоцитов из ЭСК использовали 1% ДМСО в сочетании с 10% лошадиной сывороткой ( особенно при низкой плотности агрегатов в культуре). Но самое мощное и быстрое образование сердечных мышечных клеток можно вызвать переносом гена Myo D в ЭСК. Более того, трансфицируя в ЭСК конструкцию, собранную из гена фермента аминогликозидфосфотрансферазы под промотором тяжелой цепи миозина, получали весьма активно мигрирующую популяцию кардиомиоцитов, которые активно встраивались в мышечный синцитий реципиента ( 19, 24).
Трансфицированные геном НохВ4 ЭСК наделены 50-кратно усиленным потенциалом кроветворения за счет многократного увеличения численности ранних прогениторных популяций ( 26, 13 ). У таких искусственно созданных гематогенных клонов с измененной пропорцией стволовых/прогениторных клеток в клоне в 50-100 раз выросла трансплантационная эффективность в организме реципиента.
Трансплантация генетически модифицированных ЭСК становится "тестером" для идентификации клеток-мишеней действия мутантных генов.Таким способом была установлена точка приложения гена ERY,BTK,GATA-3, SCF в контроле желточного и печеночного кроветворения. Этим же способом было выяснено участие генов Fkt, Flk в образовании желточного мешка ( 13, 26). Практически близкими способами на эмбриоидах было выяснено участие 16 Нох-генов в контроле нормального и аномального кроветворения.
:
Направленная дифференцировка ЭСК в культуре
Плюрипотентность ЭСК ( возможность получения любой специализированной линии соматических клеток взрослого организма) никем количественно не проверялась для одного источника клеток. Однако анализ всех публикаций показывает, что ЭСК тератокарциномы, бластоцисты, как и ППК дифференцируются в главные линии специализированных клеток органов. Проблемой остается направленная селективная дифференцировка ЭСК в гомогенную популяцию с единообразным нормированным фенотипом и функцией. Изучение контролируемой дифференцировки ЭСК в культуре долгое время топталось на месте, пока исследователи изучали эффекты одиночных цитокинов, ростовых факторов. Примеры монофакторно управляемой дифференцировки ЭСК весьма ограничены: в узком диапазоне концентраций ретиноевая кислота индуцирует нейрогенез, ВМР-2 - образование эпителия энтодермы, TGF-beta - преимущественно в мышечные линии, IL-6 - эритроидные линии, IL-3 - моноцитарно-миелоидные линии ( 29 ). Есть экспериментальные основания предполагать, что действие внешних инструкций реализуется через экспрессию рестрикторных транскриптаз.
За последние годы удалось расшифровать комбинации ростовых факторов, ускоряющих пролиферацию одних и тормозящих пролиферацию других провизорных клонов ин витро.Последние совместные исследования израильских, английских и американских генетиков на линии Н9 ЭСК человека выявили комбинации ростовых факторов, вызывающих предпочтительный рост клонов в дериваты мезодермы, эктодермы и энтодермы. Так, комбинация активина А + NGF-beta тормозит прогрессию клонов в энто- и эктодерму, но сильно стимулирует образование клонов мезодермального ( Brachyury) происхождения. Комбинация ретиноевой кислоты с bFGF или BMP-4 c EGF стимулирует селективную прогрессию клонов экто- мезодермы, блокируя развитие клонов энтодермы. Наконец, комбинация HGF + NGF активирует рост клонов всех зародышевых листков ( 29)
Перспективы ЭСК в медицине
Уникальные характеристики ЭСК используются в медицине по трем направлениям: 1) заместительные клеточные трансплантации 2) фармакогеномика и биология развития 3) биология репродукции человека. Потенции ЭСК к неограниченной пролиферации и вторичной дифференцировке в культуре только начинают использоваться для создания нового "биосырья" для трансплантации взамен донорских органов и фетальной ткани. Потребности медицины в новом биосырье практически неограничены: только 10-20 % людей вылечиваются благодаря удачной пересадке органа. 70-80% людей погибают без лечения на листе ожидания операции. Интересы миллионов обреченных больных людей и их семей, а также интересы миллионов диабетиков сыграли решающую роль в отмене моратория на федеральные бюджетные исследования с ЭСК. В 2000 году президент Клинтон пообещал решение проблемы диабета с помощью "биофабрик" островков Лангерганса, которые в ближайшие годы будут получены из ЭСК человека федеральной наукой. В этом разделе мы ограничимся лишь кратким перечислением клинических проектов с ЭСК , находящихся на стадии клинических и предклинических испытаний.
Летом 2000 года закончились первые клинические испытания на безопасность пересадки лабораторных нейробластов, полученных из ЭСК тератокарциномы NTERA-2 человека запатентованным способом на фирме БиоЛейтон (Калифорния, США). Незрелые клетки размножались пассажами для получения биомассы в количестве 50-100 млн клеток. Часть клеток использовалась для характеристики фенотипа и процента примесей, на отсутствие контаминации вирусами и бактериями. Далее из среды убирали LIF и фидерный слой стромальных фетальных клеток, создавая условия для направленной дифференцировки ЭСК в нейроны. Пропись "коктейля " индуцирующего 95% дифференцировку ЭСК в нейроны остается засекреченной. Далее культуру нейробластов пропускали через поточный сортировщик клеток, чтобы полностью избавиться от незрелых клеток тератокарциономы. После тщательной подготовки, вторичной очистки и характеристики фенотипа клеток для трансплантации с помощью специальной микроканюли и шприца под контролем стереотасиса и компьютерной томографии 10-12 млн нейробластов вводили в базальное ядро мозга пациента через 6 месяцев после геморрагического инсульта. Этот проект пилотного лечения пациентов после инсульта был выполнен под руководством Дугласа Канджиолка в университете Питтсбурга. 12 месячный скрининг последствий трансплантации нейронов в зону инсульта показал отсутствие побочных нежелательных эффектов в 100% случаев. У половины пациентов развивались достоверные улучшения моторной симптоматики в период 6-12 месяцев после пересадки. (17)Положительные клинические сдвиги отмечались с паралельным улучшением кровоснабжения зоны инсульта после трансплантации клеток ( средний прирост поглощения флуоресцентно-меченой 2-дезокси-глюкозы с помощью позитронной эмисионной томографии =18%, у отдельных пациентов прирост метки достигал 35-40%).( 18 ). В 2000 году в этом же неврологическом центре запущено второе клиническое испытание по оценке терапевтической эффективности биотрансплантата фирмы БиоЛейтон на 30 пациентах после инсульта. Сходные клинические испытания эффективности клеточных биотрансплантатов у пациентов после инсульта проходят одновременно в 5 клиниках США и Европы.
С середины 80-х годов трансплантацию фетальных эксплантатов в substantia nigra стали использовать для локального замещения утраченных ДОФА-эргических нейронов в мозге у пациентов-паркинсоников, страдающих выраженными двигательными расстройствами.Пересадки фетальных клеток были начаты в стриатум мозга паркинсоников первыми, поскольку научные обоснования для этой операции были корректно сформулированы ранее, чем для другой патологии мозга. Опыты на животных подтвердили необходимость направленной доставки в ограниченную зону мозга дофамина. Никакой необходимости одновременного восстановления нейрональных электрических сетевых связей между донорскими и реципиентными нейронами не выставлялось в качестве условий лечения. Сперва на мышах была разработана технология наработки больших количеств ДОФА-нейронов для пересадки в путамен и substantia nigra мышам с модельным паркинсонизмом. Около половины из 10(5) пересаженных нейронов выживали. Оказалось, пересадки прогениторных популяций ЭСК ( в отличие от дифференцированных нейронов) позволяют создавать ростки обновляемых клеток в органах ( 7 )Следовательно, прогениторные популяции более эффективно, стабильно и долгосрочно доставляют дефицитные молекулы медиатора, либо продукт нормальной алллели гена прямо в зону повреждения.
По этой причине предпочтение отдается технологиям выращивания миелин-продуцирующих олигодендроцитов из ЭСК, чтобы в зоне повреждения создавать ростки регенерации из всей иерархии необходимых для регенерации клеток. (21). На первом этапе ЭСК размножают до количества клеток, достаточных для эффективной трансплантации. На втором этапе полученную массу недиференцированных клеток направленно превращают в популяцию миелин-продуцирующих предшественников олигодендроцитов, которые маркируются селективными маркерными антигенами ( 21,3,4 ). Если популяции про-олигодендроцитов выгодно использовать для трансплантации в место демиелинизации, то смешанные популяции, сохраняющие активно мигрирующие популяции прогениторных клеток более целесообразно трансплантировать в боковой желудочек, поскольку прогениторные клетки наделены уникальной программой направленной миграции к очагам демиелинизации и механической травмы.( 31, 32 ). Снайдер и сотр. продемонстрировали уникальную способность незрелых прогениторных популяций мозга мигрировать из бокового желудочка практически в любые зоны мозга, включая мозжечок ( 31, 32). В экспериментах на нокаут-животных была хорошо экспериментально обоснована концепция лечения путем направленной "химеризации" больного мозга ростками здоровой нервной ткани, эффективно мигрирующими в случае использования ранних прогениторных популяций. Прямой визуализацией ген-меченых нейрональных стволовых клеток удалось показать, что эти клетки из левого бокового желудочка мигрируют через corpus collosum к очагам повреждения в правом полушарии ( 31,32 ) . Близкие по клеточному строению и методам получения клеточные нейротрансплантаты- производные ЭСК - сейчас используются в эксперименте и первых клинических испытаний для коррекции мозговой и спинной травмы, лечения сирингомиелии, рассеянного склероза, наследственных дефектов мозжечка и т.п.
ЭСК и их производные широко сейчас используются для разработки методов коррекции иммунодефицитов, вызванных генетическими дефектами созревания тимуса. В этих исследованиях используют нокаут Rag-/- мышей с пораженным аппаратом рекомбинации V(D)J локусов TCR генов, что приводит к полной утере функции Т и В лимфоцитов. Пересадки ранних предшественников ЭСК в тимус пораженных животных приводит к восстановлению созревания нормальных популяций иммунных клонов, ответственных за гуморальный и клеточный иммунитет. Пересадки ранних дериватов ЭСК, генерируемых в условиях культуры, далее используют для лечения фатальных наследственных анемий детей. Дальнейшее расширение этих примеров нецелесообразно, поскольку в фокусе статьи остается клеточная биология ЭСК.
Мезенхимальная стволовая клетка
В эмбриогенезе человека и млекопитающих образование нескольких сотен вариантов специализированных клеток происходит из пула зародышевых листков (экто-, энто- и мезодермы), а также мезенхимы. Эмбриональная мезенхима - это клеточная сеть рыхлой соединительной ткани, выполняющая множественные метаболические, сигнальные, механические (опорные) и морфогенетические функции. Конденсация мезенхимы за счет клоногенного роста прогениторных клеток запускает синтез первичных морфогенетических сигналов, ведущих к закладке органов. Одновременно мезенхима обеспечивает опережающее развитие коммуникаций (кровеносные и лимфатические сосуды), а также формирует клеточный каркас (строму) органов. Интенсивная миграция мезенхимальных клеток во время органогенеза необходима для "разметки" трехмерной "карты" будущих органов и рестрикции действия гомеотических Нох- генов, определяющих будущие размеры и границы органов. Независимое происхождение и множественные функции мезенхимы во внутриутробном развитии подчеркивают множественность функций этой гетерогенной клеточной сети. Печень, почки, легкие и другие органы собраны из повторяющихся "функциональных единиц" специализированных клеток (паренхимы) среди "прослоек" мезенхимы, формирующей каркас органа, кровеносные и лимфатические сосуды . Изучение стволовых клеток паренхимы кроветворной, иммунной и нервной ткани значительно обогнало изучение стволовых клеток мезенхимы тех же органов.
Первые направленные поиски мезенхимальной стволовой клетки (МСК) начались в результате методического прорыва, разработанного Александром Яковлевичем Фриденштейном в середине 70-х годов ХХ века. ( 11 ) В его лаборатории впервые была получена однородная культура плюрипотентных стромальных стволовых клеток костного мозга, прикрепленных к подложке, которые сохраняли высокий темп размножения в недифференцированном состоянии во многих пассажах. В малых плотностях МСК после прикрепления формировали клоны фибробластоподобных нефагоцитирующих клеток. После прекращения деления стромальные клетки под влиянием условий культивирования превращались в костную , жировую, хрящевую, мышечную или соединительную ткань. ( 11 ) Пионерские разработки А.Я.Фриденштейна, инициировавшие поиски стволовой клетки мезенхимы, заслужили международное признание. При систематическом введении МСК в кровоток животным-реципиентам, незрелые клетки имплантируются в разных органах и тканях, дифференцируясь в клетки крови, миоциты, адипоциты, хрящевые клетки, фибробласты. При введении в желудочки мозга или белое вещество МСК мигрируют в паренхиму нервной ткани и дифференцируются в глию (реже - в нейроны). . МСК способны превращаться в стволовые гематогенные клетки как ин витро, так и ин виво.
В культуре сеть стромальных прогениторных клеток служит "фидером" (питающей клеточной основой) для вызревания всех клонов гематогенных клеток. Уникальные потенции МСК уже начинают использоваться в клинике для восстановления численности и функции клеток в поврежденных органах. ( 25)
Источники и характеристики МСК
Костномозговая ткань человека и млекопитающих остается предпочтительным источником извлечения МСК . Сеть стромальных клеток заполняет пространство между капиллярами (синусоидами) и костью. Доля истинных "покоящихся" МСК в костном мозге взрослого человека не превышает 0,01-0,001%, т.е. сопоставима с количеством гематогенных стволовых клеток (ГСК). Баланс ГСК/МСК играет важную роль в кроветворении. Свежеизолированные МСК в суспензии, не прошедшие через культуру, не имеют на поверхности рецепторов адгезии ( СD34, VCAM, ICAM, коллаген I и III типа, CD-44 - лиганд для взаимодействия с гликановым матриксом, СD-29- бета-1-интегрина ). К подложке культуры прикрепляются не стволовые, а прогениторные субпопуляции клеток, формирующие цитоскелет и аппарат клеточной адгезии. Прикрепленные стромальные клетки хорошо размножаются в культуре, сохраняя маркеры слабо дифференцированных клеток (SH2 - рецептор для TGF-beta, SH3 - домен сигнального белка, коллаген I и III типа, фибронектин, рецепторы адгезии VCAM-1 (CD106) и ICAM(CD54), кадхерин-11, CD44, CD71- рецептор трансферрина, ,CD90,CD106 - VCAM-1, CD120a , CD124). МСК не имеют антигенов гематогенной стволовой клетки - CD34, CD14 и CD45. Вторая важная особенность МСК - рост культуры клонами. Часть клонов МСК человека удается многократно пассировать и получать миллионы генетически однородных прогениторных плюрипотентных клеток. За 2-3 пассажа удается нарастить от 50 до 300 млн незрелых клеток, сохраняющих выше перечисленные маркеры. После прекращения деления эти клетки в плотной культуре дифференцируются в адипоциты, миоциты, клетки хряща и костной ткани. Фибробласты кроветворной ткани этой способности не имеют. Например, до 95% адипоцитов возникают из стромальных незрелых клеток при добавлении в среду культивирования трех сигналов -1-метил-изобутилксантина ( повышающего уровень внутриклеточного цАМФ ), дексаметазона и индометацина ( ингибитора синтеза тромбоксана ). Фенотип жировых клеток верифицируется по экспрессии гена, либо активности фермента липопротеинлипазы, белка-транспортера жирных кислот и рецептора пероксисом. Из того же пула стромальных прогениторных клеток с помощью TGF-beta получают однородную популяцию хрящевых клеток в бессывороточной среде. Дифференцирующиеся клетки формируют многослойную культуру с развитым межклеточным матриксом, состоящим из протеогликана и коллагена II типа. Клетки костной ткани образуются из той же культуры стромы с помощью трех сигналов ( бета-глицерофосфата- донора неорганического фосфата, аскорбиновой кислоты и дексаметазона в питательной среде с 10% фетальной сывороткой). Сперва образуются клеточные агрегаты, в которых возрастает уровень шелочной фосфатазы и остеопонтина , а также накапливается внутриклеточный кальций .
В эмбриогенезе функции мезенхимы связаны с выработкой сигналов, запускающих региональную пролиферацию прогениторных клеток эпителия. Если мезенхимальные клетки продуцируют ростовые факторы (HGF, TGF-alpha, EGF, KGF), то паренхимальные прогениторные клетки экспрессируют на своей поверхности рецепторы к указанным сигналам.
В дифференцированной взрослой ткани стромальная сеть клеток генерирует сигналы для поддержания жизнеспособности и пролиферации прогениторных клеток (SCF,HGF, IL-6, Il-7, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, M-CSF, Flt-3, LIF). Большинство прогениторных клеток локализовано вокруг региональных стволовых клеток. 80% прикрепленных к подложке стромальных клеток в первичной культуре активно пролиферируют. Фенотип стромальных клеток весьма гетерогенен, что связано с множественностью их функций. Практически любая стромальная клетка сохраняет способность к дифференцировке в клетки жировой, костной или хрящевой ткани. Никакой рестрикции плюрипотентности не удалось выявить среди МСК и прогениторных популяций. Для доказательства плюрипотентности стромальных клеток проверяли более 200 клонов МСК, изолированных из одной первичной культуры. Более 80% клонов in vitro сохраняли остеогенный, хондрогенный и адипогенный потенциал. Пересадки стромальных клеток под капсулу почки или в диффузионную камеру ( блокирующую миграцию хозяйских клеток) ранее всего использовались для доказательства их плюрипотентности.Стромальные клетки сохраняют гетерогенный фенотип ин ситу. Множественность фенотипа подтверждает отсутствие факторов рестрикции in situ. Многими иследователями показана перекрестная дифференцировка стромальных адипоцитов в остеобласты и наоборот. Множественность фенотипа и пластичность фенотипа клеток, повидимому, определяется крайне скудным развитием экстраклеточного матрикса стромы костного мозга. ( 25, 28 )
Незрелые СD-34- минус стромальные клетки выявлены в циркулирующей крови. Таких клеток в костном мозге много меньше чем CD34+ предшественников ( одна клетка на миллион клеток костного мозга) (28,29,30).
В культуре эти клетки прикрепляются к подложке, формируя островки фибробластоподобных клеток. В незрелом состоянии клетки пролиферируют в течение нескольких пассажей, сохраняя плюрипотентность ( способность дифференцировки в линии адипоцитов, миофибробластов, стромы гематогенной ткани, клетки хряща и кости. Ограниченная популяция СD-34 -негативных стромальных клеток из кровотока возвращается в строму костномозговой ткани, где трансформируется в линии CD-34+ гематогенных стволовых клеток. Эти наблюдения позволили заключить, что рециркуляция прогениторных мезенхимальных клеток в кровотоке позволяет поддерживать баланс стволовых клеток в разных органов через общий пул клеток. (28-30)
Трансплантация МСК в медицине
Многие специалисты склоняются к мнению, что стромальная основа всех органов и тканей млекопитающих и человека возникает из общего пула МСК уже на стадии органогенеза. В взрослом организме основная часть МСК сохраняется в строме рыхлой соединительной и костной ткани. Основную часть стромы соединительной и костной ткани составляют более продвинутые прогениторные клетки. Прогениторные клетки наделены способностью размножаться клонами в культуре.Более 20% вводимых в кровоток прогениторных клеток активно захватывается стромой кроветворной ткани и стромой паренхиматозных органов. Имплантация и репопуляция аллогенных МСК сопряжена с низкой иммунной реакцией и локальным воспалением. Низкая антигенная активность МСК связана не только с отсутствием экспрессированных комплексов гистосовместимости, но и наличием целого ряда иммуносупрессорных белков. Эти характеристики определяют терапевтические возможности МСК как нового биосырья тканевой регенерации, имеющей огромные перспективы в медицине ближайшего будущего. Мы ограничимся лишь рассмотрением нескольких примеров. Фирма Osiris Therapeutics создала коммерческую линию МСК, получаемую из биоптатов костного мозга доноров. Из одного биоптата выделяют порядка 100000 очищенных МСК, которые за счет пассажей удается превратить в 500 млн незрелых клеток. Далее эти незрелые клетки вместе с гематогенными стволовыми/прогениторными клетками вводят в кровоток для колонизации костного мозга раковых пациентов, прошедших курсы радио/хемотерапии с целью восстановления пула резервных стволовых/прогениторных клеток стромы и кроветворения. Эффективность клеточной терапии во многих случаях выше при одновременном введении стволовых клеток стромы и кроветворения. Пересадки "новой" стромы позволяют снизить затраты на лечение весьма дорогими цитокинами и ростовыми факторами, сократить послеоперационный период восстановления кроветворения, а также число летальных случаев после процедуры неселективного разрушения региональных и циркулирующих раковых клеток, которые погибают вместе с пулом собственных прогениторных кроветворных ростков. Аллогенные и аутогенные пересадки МСК используются сейчас для лечения множественной миеломы, апластической анемии и спонтанной цитопении - заболеваний с первичным дефектом стромы в гематогенной ткани. Пересадки МСК используются сейчас для лечения врожденной хрупкости костей ( brittle bone disease), вызванной дибалансом остеобластов/остеокластов в костной ткани. Восстановление костеобразования достигается за счет "химеризации" пула стволовых/прогениторных клеток в костной ткани пациентов. Ростки донорской костной ткани восстанавливают утраченный баланс обновления реципиентной костной ткани путем множественных влияний на ткань реципиента. Донорские клетки пересаживают на трехмерном керамическом или протеогликановом матриксе с множественными полостями ( типа губки). Проходят первые клинические испытания культуры мезенхимальных прогениторных клеток в лечении сложных переломов кости, когда возможности регенерации кости ограничены. Собственные и аллогенные мезенхимальные клетки используются для создания "искусственного хряща" в культуре с целью подсадки и коррекции дефектов суставного хряща после травмы или аутоиммунных поражений.
Наконец, экспериментальные пересадки мезенхимальных стволовых клеток в паренхиму мозга животных показали, что донорские незрелые клетки трансформируются как в популяции нейронов, так и глии.( Ростки здоровой донорской мезенхимальной ткани исправляют врожденные аномалии метаболизма мозга в случае болезни Гоше, других болезней накопления накопления липидов, ганглиозидов или углеводов.
В недалеком будущем клетки мезенхимальных предшественников будут использоваться в нейрологии для направленной химеризации клеток мозга и создания здорового пула клеток мозга, способного генерировать фермент или фактор, лимитирующий клинические проявления заболевания.
Известно, что "гнезда" стромальных клеток, содержащих стволовые региональные клетки, являются мощным иммунологическим барьером, защищающим стволовые клетки от бактерий, вирусов и чужеродных антигенов. Например, клетки Сертоли, окружающие мужские прогениторные половые клетки и после рождения, нашли оригинальное применение в экспериментальной неврологии. Их смешивают с нейрональными стволовыми клетками при трансплантации. Выживание нервных стволовых клеток в паре с клетками Сертоли возрастает в несколько раз за счет трофических и барьерных функций герментативной стромы.
Заключение
Рассмотрены последние достижения в изолировании, особенностях культивирования и роста клоногенной культуры эмбриональной стволовой клетки человека и млеокпитающих ( включая особенности гено-фенотипа клеток в цикле пролиферации/дифференцировки). Описаны морфологические,иммунохимические и биохимические маркеры, включая особенности поведения в культуре и при трансплантации в зародыш. Рассмотренные фундаментальные данные, полученные на стыке эмбриологии, клеточной биологии и функциональной геномики, дают некоторые обоснования к практическому использованию ЭСК в медицине. Рассмотрены основные характеристики, фентипические маркеры, особенности роста и дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток человека и млекопитающих, а также пути их использования в трансплантационной медицине.
Summary
The recent achievements in isolation, primary and long term culturing, cell lmmunophenotyping, SAGE profiling, the clonogenic growth parameters of embryonic stem cells and mesenchymal stem cells have been outlined in connection with cell pluripotency and restricted differentiation, mediated by signals both in culture and in situ. Multidisciplinary data obtained by cell biologists, embryologists with recent functional genomic data give the new way for practical implementation of bioimplants derived from embryonic stem cell for cell-replacement therapy .
Литература
1.Bianco P., Robey P. Mesenchymal Stem Cell: clinical applications J. Clin. Invest. 2000,v.105, P.1663-68
2.Boeuf H.,C.Hauss, F.DeGraeve et al.; LIF factor dependent transcriptional activaton of embryonic stem cells; J.Cell Biol.,1997,v.138; P.1207-17
3.Brьstle O, Jones K, Leraish R, et al. Embryonic stem cell-derived glial precursors: a source of myelinating transplants. Science. 1999; v,285: P. 754-756
4.O.Brustle, K.Choudhary, R.D.McKey et al.; Neuronal stem cells Nature Biotechnol.1998,18, 1040-44
5.Capecchi, M.R. (1989) Altering the genome by homologous recombination. Science v. 44: P. 1288-1292
6. David C., Colter R.C., C, D. Prockop et al. Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, v.97, P.3213-3218.
7. Deacon T, Dinsmore J, Costantini LC, Blastula-stage stem cells can differentiate into dopaminergic and serotonergic neurons after transplantation, Exp Neurol 1998 v.149 P. 28-41
8. Deans RJ, Moseley AB , Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses. Exp Hematol, 2000, v. 28, P.875-84
9. Deutschman T.C., Eistetter H.,Katz M. et al.: The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines; Embryol.Exptl.Morphol.,1985,v, 87, P.27-45
10. Evans, M.J., and M.H. Kaufman Establishment in culture of pluripotent cells from mouse embryos. Nature (Lond.). 1981, v.292: P. 154-156 ;
11. Friedenstein AJ, Petrakova KV, Kurolesova AI, Frolova GP . Heterotopic of bone marrow.Analysis of precursor cells for octeogenic and hematopoeietic tissue; Transplantation 1968 , v..6: P.230-47;
12.Geiger H., Sick S., Bonifer C. et al; Globin gene expression is reprogrammed in chimeras generated by injecting adult hemopoietic stem cells into mouse blastocyst; Cell, 1998 v.93: P.1055-65
13. Hegalson C.D., Souvageau G., Lowrence H.J. et al.;Hematogenic stem cells, Blood,1996,v. 87,P. 2740-49
14. Hauss R, Lange C, Weissinger EM, Kolb HJ, et al. Evidence of peripheral blood-derived, plastic-adherent CD34(-/low) hematopoietic stem cell clones with mesenchymal stem cell characteristics. Stem Cells, 2000; v.18, P. 252-60
15. Itskovitz-Eldor J, Schuldiner M, Karsenti D et.al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med 2000 Feb;6(2):88-95.
16.Kelli D.L., Rizzino A.; DNA Microarray analysis of genes regulated during the differentiation of embryonic stem cells; Mol.Reprod.Devel.,2000, v.56, P.113-23.
17. Kondziolka D, Wechsler L, Goldstein S, et al. Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke. Neurology 2000; v.55: P.565-9.
18. Krebsbach P.H., Kuznetsov S.A., Bianco P. et al. Bone marrow stromal cells: characterization and clinical application.Crit Rev Oral Biol Med 1999; v.10: P.165-81
19. Leiden J.M. Beating the odds: a cardiomyocyte cell line at last; J.Clin.Investig.,1999,v.103,P.591-2;P.697-705;
20. Lewis R. A stem cell legacy: Leroy Stevens; The Scientists, A Stem Cell Legacy: The Scientist, 2000, v.14:P.19-24.
21. Liu S.,Qu Y.,Stewart T.J. et al. Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation; Proc.Natl.Acad.SciUS; 2000, v.97, P.6126-31
22. Martin, G.R. (1981) Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78: 7634-7638
23. O'Shea K.S. Embryonic Stem Cell Models of Development; Anat.Rec.,1999, v.257, P. 32-41
24.Pittenger, M.F.; Mackay, A. M.; Beck, S. C.; et al., Multilineage potential of Adult Mesenchymal stem cells Science, 1999, v. 284, P. 143-47
25. Robertson, E. Pluripotential stem cell lines as a route into the mouse germ line. Trends Genet. 1986, v.2: P. 9-13
26. Robey P.G Stem cells near the century mark J Clin Invest, 2000,v.105, P.1489-1491
27. Saburi S, Azuma S, Sato E, et al., Developmental fate of single embryonic stem cells microinjected into 8-cell-stage mouse embryos. Differentiation 1997, v.62: P.1-11
28 Shamblott M.J.,J. Gaerhart et al.Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells; Proc.Natl.Acad.Sci.US; 1998,v.95, P.13726-31
29. Schuldiner M.,O.Yanuka, J.Itskovitz-Elder et al. Effects of 8 growth factors on the differentiation of human embryonic stem cells; Proc.Natl.Acad.SciUS,2000,v.97, P.11307-312
30. Thomson J. et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocyst; Science;1998,v.282, P.1145-47
31. B.D. Vandava,L.L. Billinghurst. E.Snyder; Global cell replacement is feasible via neural stem cell transplantation: evidence from the demyelinated shiverer mouse brain; Proc.Natl.Acad.SciUS, 1999,v.96, p.7029-34 32. E.Snyder, Grafting immortalized neurons to the damaged CNS Curr.Opin.Neurobiol.,1994, v.4, P.742-51;